近日，中南大学医学遗传学研究中心梁德生教授团队在CRISPR/Cas12a核酸检测技术研究中取得新进展，题为“基于单链DNA修饰crRNA的RPA-Cas12a一步法灵敏、可视化的检测SARS-CoV-2（Sensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using RPA-Cas12a one-step assay withssDNA-modified crRNA）”的研究成果在化学领域国际权威期刊《分析化学学报》（ANALYTICA CHIMICA ACTA）上发表。中南大学硕士研究生曾钦龙、南华大学周妙金教授和中南大学硕士研究生邓巍衡为该论文的共同第一作者，梁德生教授、邬玲仟教授和李卓教授为共同通讯作者，中南大学生命科学学院为第一通讯单位。本研究受国家自然科学基金、国家重点研发计划等项目支持。

CRISPR/Cas12a一步法已经广泛应用于病原体核酸的检测。但是，在一步法反应中，Cas12a会与等温扩增（RPA）竞争并剪切目标DNA，从而导致该方法的检测能力下降。因此，提升一步法灵敏度的关键是平衡RPA与Cas12a检测。在此前的研究中，该团队发现单链DNA修饰crRNA（mD-crRNA）在一步法中的灵敏度比野生型crRNA提高了100-1000倍。并且，mD-crRNA比野生型crRNA具有更好的稳定性。研究人员利用mD-crRNA开发了快速、高灵敏检测DNA病原体（包括GBS和HPV16/18）的Cas12a一步法技术CasDOS。然而，关于CasDOS灵敏度提高的机制仍不清楚。

本研究摘要图

本研究中，梁德生教授团队阐明了mD-crRNA介导的Cas12a一步法核酸检测的反应机制，并将该方法拓展至RNA病原体SARS-CoV-2的检测。机制研究发现，mD-crRNA在一步法反应中的灵敏度高于野生型crRNA是由于mD-crRNA 3’末端添加的单链DNA减弱了Cas12a-mD-crRNA复合物与目标DNA的亲和力，导致Cas12a顺式、反式剪切活性的降低，这种改变使得Cas12a减少了对目标DNA的剪切，使一步法反应中，更多的目标DNA被用于RPA，从而积累Cas12a检测产物，最终提升了检测能力。此外，通过对CasDOS反应体系的全方位优化，包括RPA试剂、逆转录引物、荧光探针及反应温度等，研究人员成功将该方法应用于SARS-CoV-2的特异性检测，灵敏度达到5 aM，并可在紫外灯下可视化观察结果。临床标本试验中，CasDOS检测40例SARS-CoV-2 RNA标本与qPCR的结果一致性为97.5%。

该研究阐明了mD-crRNA介导的Cas12a一步法核酸检测反应机制，为解决一步法反应中等温扩增和CRISPR检测之间的不兼容性问题提供重要指导意义。同时该研究进一步拓展了CasDOS检测技术的检测范围，建立了高灵敏度、高特异性、可视化的SARS-CoV-2检测体系。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S000326702400494X

撰稿 曾钦龙，一审 梁德生、二审 胡艺俏、三审 陈超